O acervo do Museu de São Roque integra colecções de pintura, escultura, ourivesaria, iluminura, têxteis, relicários e frontais de altar do séc. XVI ao séc. XIX.
Integra igualmente o seu acervo o Tesouro da Capela de S. João Baptista, composto por peças de uso litúrgico, das quais se destaca a ourivesaria e paramentaria, executada por artistas italianos na primeira metade do séc. XVIII, em Roma.

O acervo do Museu é constituído maioritariamente pela colecção doada em vida e em testamento por parte da família de José Luciano de Castro à Santa Casa da Misericórdia de Anadia, designadamente objectos de família e objectos pessoais de José Luciano de Castro. Este acervo integra além de uma colecção monográfica sobre José Luciano de Castro, colecções de pintura, escultura, ourivesaria, mobiliário, numismática e traje civil e fardas diplomáticas de finais do século XIX.
Merecem ainda destaque dois painéis de retábulo, intitulados de S. Jerónimo e de Santa Helena, a imagem de Santa Ana em madeira estofada e policromada do século XVIII, o retábulo de São Gonçalo de Amarante, e um crucifixo em marfim indo-português.
O Museu possui ainda uma colecção de malacologia.